FFPE vzorky a izolace NA z různých tkání a buněk hrají klíčovou roli v genotypizaci a analýze DNA a RNA prostřednictvím metod jako PCR. Proces izolace zahrnuje homogenizaci, lyzování, odstranění kontaminujících bílkovin a dalších nečistot a následné čistění NA tak, aby byla vhodná pro další analýzy.
Různé přístupy k extrakci DNA a RNA
Nejčastějšími metodami jsou organické extrakce (fenol-chloroformová technika) a extrakce na pevné fázi (silika či magnetické kuličky). Každá z metod má své výhody a omezení, která je třeba zvážit při výběru postupu pro konkrétní vzorek.
Fenomény a principy organické extrakce
Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. První krok je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány.
Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze.
Poté se ke směsi přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování).
Extrakce na pevné fázi a magnetická separace
Přidání vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Speciální komponenty a jejich vliv na analýzu
Purifikovaný glykogen (zbavený DNA, RNA a proteinů) může neinterferovat s většinou DNA-protein interakcí a enzymových reakcí, ale může inhibovat některé DNA-protein interakce. Inertní neutrální nosič neinterferuje s DNA-protein interakcemi ani enzymovými reakcemi a neinterferuje s určováním koncentrace RNA/DNA.
Souprava Cytoplasmic and Nuclear RNA Purification byla navržena pro rychlou izolaci a purifikaci RNA z cytoplazmické i jaderné části buňky, a to s vysokou citlivostí a eliminací interferencí při následné analýze. Tato část popisuje obecné principy a typické kroky spojené s izolací RNA.
Parametry kvality a zkoušky čistoty
Přesnost a čistota RNA jsou určovány poměry absorbance (např. R260/R280) a průběhem RT-PCR či QRT-PCR, které potvrzují amplifikovatelnost vzorků a minimální kontaminaci DNA. V některých sadách mohou být rozdíly v kvalitě RNA spojeny s použitými kity a metodami.
Někdy mohou být vzorky kontaminovány DNA, což je důležité zvláště pro RT-PCR. Příkladem zmiňovaným je, že některé soupravy mohou vést k detekci DNA i v RNA izolátech, pokud nejsou řádně odstraněny kontaminující genetické materiály.
Indikace a praktické poznámky pro izolaci RNA z tukové tkáně
Tato část shrnuje praktické poznámky pro izolaci RNA z adipózní tkáně a zpracování vzorků pro následné PCR metody. Příklady zahrnují použití různých kitů a parametry, které ověřují kvalitu RNA, jako jsou hodnoty R260/280 a výsledky RT-PCR.
Výsledky a srovnání kitů
Objem vzorků a kvalita RNA mohou být ovlivněny použitými sadami, například různé kitové soupravy mohou vykazovat odlišné průměrné koncentrace RNA a poměry čistoty, které jsou poté ověřovány RT-PCR analýzou. Závěry ukazují, že některé sady RNA poskytují vyšší množství RNA a vhodnější poměry pro PCR.
V vašem experimentálním kontextu lze vycházet z uvedených parametrů a porovnávat výtěžky a čistotu pomocí standardních metod RT-PCR a QRT-PCR.
Praktické tipy pro práci s FFPE vzorky a RNA
FFPE vzorky se běžně používají pro histologii a imunohistochemii a mohou být deklaifikovány pro následné izolace RNA a DNA. RNA z parafinových bloků může nabídnout celkové RNA, která by jinak nebyla dostupná, avšak je fragmentovaná a často v menší čistotě a s nižším výtěžkem. Před izolací je nutné vzorky připravit a vzorek může být omezen co do kvality a kvantity RNA.
IZOPOOL jako náhrada betonáže bazé[email protected]
Historie a souvislosti s literaturou
Různé studie uvádějí techniky izolace RNA z tukové tkáně a z dalších typů vzorků, včetně ukázek, že RNA může být detekovatelná z různých zdrojů i při degradaci, pokud jsou postupy vhodně voleny a výsledky validovány RT-PCR.